Super-Photostable Phosphole-Based Dye for Multiple-Acquisition Stimulated Emission Depletion Imaging
C. Wang, M. Taki, Y. Sato, A. Fukazawa, T. Higashiyama, S. Yamaguchi,
J. Am. Chem. Soc., 139, 10374-10381 (2017).
[DOI: 10.1021/jacs.7b04418]
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STED顕微鏡は,2014年のノーベル化学賞に選ばれた超解像顕微鏡技術の一つで,従来の蛍光顕微鏡の限界を大きく上回る空間分解能で製麺現象を可視化できる画期的なイメージング手法である.しかし,超解像顕微鏡には強いレーザー光の照射が必要であるため,撮影中に蛍光色素が速やかに分解し,褪色してしまうという大きな問題が存在する.蛍光標識した細胞を超解像レベルで連続的に撮影できれば,細胞内の微細構造の三次元的なイメージングや,細胞小器官や分子の動きをリアルタイムかつ長時間にわたって観察することが可能になる.このような理想の超解像イメージングを達成するためには,圧倒的に高い耐光性をもつ蛍光標識剤の開発が不可欠であり,生命科学研究の分野で待望されていた.これに対し,今回我々は,生体分子と結合可能な官能基をもつ超耐光性蛍光標識剤 PhoxBright 430 (PB430) を新たに開発した.
PB430 を蛍光標識剤として細胞内構造を部位特異的に染色することで,従来の蛍光標識剤では耐光性が障害となっていた STED 顕微鏡による連続撮像や,三次元画像の取得が可能となることを示した.さらに,従来の蛍光色素との耐光性の違いを利用した新たなマルチカラーイメージングの手法を考案し,一対の励起レーザーとSTEDレーザーのみでマルチカラー STED イメージングを達成した.この結果は,STED イメージングをはじめとして蛍光色素の耐光性が障害となっていた多くのイメージング技術に新たな展開をもたらしうる成果であると位置付けられる.
As stimulated emission depletion (STED) microscopy can provide structural details of cells with an optical resolution beyond the diffraction limit, it has become an indispensable tool in cell biology. However, the intense STED laser beam usually causes rapid photobleaching of the employed fluorescent dyes, which significantly limits the utility of STED microscopy from a practical perspective. Herein we report a new design of super-photostable dye, PhoxBright 430 (PB430), comprising a fully ring-fused π-conjugated skeleton with an electron-accepting phosphole P-oxide unit. We previously developed a super-photostable dye C-Naphox by combining the phosphole unit with an electron-donating triphenylamine moiety. In PB430, removal of the amino group alters the transition type from intramolecular charge transfer character to π–π* transition character, which gives rise to intense fluorescence insensitive to molecular environment in terms of fluorescence colors and intensity, and bright fluorescence even in aqueous media. PB430 also furnishes high solubility in water, and is capable of labeling proteins with maintaining high fluorescence quantum yields. This dye exhibits outstanding resistance to photoirradiation even under the STED conditions and allows continuous acquisition of STED images. Indeed, using a PB430-conjugated antibody, we succeed in attaining a 3-D reconstruction of super-resolution STED images as well as photostability-based multicolor STED imaging of fluorescently labeled cytoskeletal structures.
超解像イメージングで細胞内の微細構造をみつづける:超耐光性蛍光標識剤の開発
2017/08/02